微生物污染的检测采样

1、生物污染的检测采样仪器的选择原则
（1）了解与分析所需采样的活性粒子的类型
由于不同微生物自身的粒径不等，生存形态各异，有效的载体不同等等，这些区别与差异都会影响采样方法和采样仪器的选择。因此，必须有针对性的选择采样仪器方能获得可靠的测量值，在这一点上与空气中悬浮微粒的检测相比显得更为复杂。
（2）该活性粒子对采样方法的敏感性
例如某些活粒子凝块易被冲击采样器的冲击力所破碎，造成活性粒子采样的机械损失而影响采样效率。对于此类活性粒子则宜避免选用这类采样方法。
（3）活粒子的预期浓度
这也是需要根据经验作出预判断的一个方面，例如活粒子浓度很高时，在某种仪器的小采样量条件下获得的采样结果，也会因菌落重叠，难于计数，而造成较大的检测误差。
（4）危险区的可达性
所设定的生物污染控制危险区往往不适宜采样或采样的风险较大。例如，靠近手术切口上方空气的含菌浓度是空气环境对感染率产生影响的敏感部位，而恰恰在这个部位进行检测采样存在较多的困难与隐患，可能影响、干扰医护人员的操作，存在较大的医疗事故风险。对于手术中的这个生物污染控制的危险区域，采样仪器往往是不能进入的，即存在不可达性的问题。基于这种情况，就要安排其它合适的检测采样位置，而该部位的测值应是能反映危险区域生物污染控制效果的。
（5）极低程度生物污染的检测能力
对于这种情况要事前判定所选采样仪器是否能反映真实情况。譬如在ISO 5级以上的洁净室中，由于空气洁净度很高，悬浮微粒稀少，如用沉降平皿采样，则其平皿数或沉降面积和暴露时间都要大量增加，才有可能满足检测概率的要求。否则，按常规方法操作，平皿的读值都可能为“0”，但这并未反映低浓度污染的真实情况。因此，在对极低程度生物污染环境选择检测仪器和方法时，要格外重视其检测能力。如果使用其它带吸气动力源的微生物采样装置时，其采样空气量、采样持续时间也应与一般污染环境不同，要依据采样概率来分析与计算必要的采样空气量，再决定所选仪器的单位时间采样量和采样时间。
（6）采样仪器对所监测工艺或环境的影响
这也是选择检测仪器和检测方法时必须考虑的问题。例如某些微生物采样器噪声较大，如果用于手术中的微生物采样，就要顾忌其是否影响、干扰医护人员的正常操作。
2、采样计划的制定
采样计划首先应该明确所检测、监测的生物污染控制区的洁净度、生物污染控制水平，这些指标是依据工作人员的安全、保护工艺和保证产品的质量，以及保障环境的需要来确定的。这些指标通常由业主、使用单位提出。
（1）采样计划
采样计划必须以正式文件的形式确定下来，以作为生物污染检测工作所依据的证明文件。此文件经业主、承包商或检测单位共同认可，并符合国内、的相关规范。这个有关采样计划的证明文件，对生物污染数据的准确评价与解释是*的。采样计划中应明确检测时该区域所处的状态。一般情况下，生物污染检测是在动态条件下，甚至选择在该区域活动频繁的时间段。当然，静态条件下的检测也是需要的，它能对洁净室的设计与效能提供有用的信息，并可作为运行中比对的原始资料。采样计划文件中应就检测状况予以明确规定。
（2）采样点的选择与数量
除均布测点外，危险区域通常宜增点测点。例如生物洁净手术室的手术床周围，一般都会额外增设测点。
1）沉降菌
我国国家标准GB/T 16293-1996《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》（2006版的《医药工业洁净厂房设计规范》仍遵循此测试方法）中关于测点的规定如下表：
沉降法的少采样点数目

注：表中的面积，对于单向流洁净室，是指送风面积；对于非单向流洁净室是指房间的面积
表中的洁净度级别，依原有习惯按美国联邦标准209的分级划分，表中的英制100级相当ISO 5级，10000级相当于ISO 7级，100000级相当于ISO 8级。
表中所规定的沉降菌测点数与住房和城乡建设部行业标准JGJ 71-90 《洁净室施工及验收规范》所规定的空气中悬浮微粒采样的低采样点数是*一致的。
工作区采样点的位置，一般略高于工作面，即离地0.8～1.5m。
在关键设备或关键活动范围处可增加采样点。
根据ISO 14644-1的规定，空气中悬浮微粒测定的采样点数较之大为削减，至于沉降菌的测点数是否参照现行标准执行，尚有待研究决定。尤其是在动态条件下按国内现行标准进行沉降菌的监测，表中所列测点数对于面积较大的高级别生物洁净室，在实施时困难是较大的。
2）浮游菌
我国国家标准GB/T 16294-1996《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》中（2006版的《医药工业洁净厂房设计规范》仍遵循此测试方法）关于测点的规定如下表所列，表中区别验证与监测两种不同情况给出了不同的采样点数。
浮游菌测试的少采样点数目

注：1、表中的面积，对于100级的单向流洁净室，包括层流工作台，指的是送风口表面积；对于10000级、100000级的非单向流洁净室，指的是房间面积。
    2、日常监测的采样点数目由生产工艺的关键操作点来确定。
浮游菌采样测点的位置一般离地面0.8～1.5m。送风口测点位置一般距出风面0.3m左右，测点位置也宜离开污染较集中的回风口1m以上。对于关键设备与关键工作活动范围处宜增加测点数。
3）采样点均布方法
对于均布采样点的布置方法，GB/T 16293-1996和GB/T 16294-1996还提供了一些测点布置图供参考：

国家标准GB 50333-2002《医院洁净手术部建筑技术规范》关于不同级别手术室监测时的测点数与位置如下表所列。无论是尘粒数、浮游菌、沉降菌采样，均按下表执行。

手术室面积一般在20～60m²范围，通常是高级别的面积较大，低级别的面积稍小。以单位面积的测点数推算，上表所列采样点数与国内现行的其它标准基本一致。
3、采样量的要求
采样量偏小可能提供不了具有代表性的结果，过大的采样量又将增加工作量，降低工作效率，国标GB/T 16293、GB/T16294分别作出了一些规定，可供参考。
（1）沉降菌
GB/T16294-1996对于沉降菌的培养皿数有如下规定：在满足所规定的少测点数的同时，还宜满足所规定的少培养皿数，如下表所列：
国家标准GB 50333-2002《医院洁净手术部建筑技术规范》对沉降菌测试少培养皿数规定如下表所列：

（2）浮游菌
GB/T 16293-1996关于浮游菌检测时，根据日常监测与环境验证的不同情况，给出了每次小采样量的规定值，如下表所列：

国家标准GB 50333-2002《医院洁净手术部建筑技术规范》对悬浮微粒采样量的规定是：每次采样的小采样量100级区域为5.66L，以下各级区域为2.83L。关于浮游菌的测试，GB 50333-2002的规定如下表所列：

4、检测与监测的频率
生物污染受控环境的检测与洁净室的检测相类似，在建设与常规运行过程中应有以下的检测计划。
（1）竣工验收检测；
（2）生物洁净室综合性能评价；
（3）定期监测。
此外，发生以下情况时需要额外安排检测或调整监测频率，其中有些情况也是生物污染受控环境所*的。
（1）生物污染受控环境连续超过报警值或动作值，需立即进行干预，以查明原因并采取纠正措施。
（2）生物洁净室长期停运之后，在正式启用之前需进行检测。
（3）在危险区检测到传染媒介时。
（4）对通风空调净化系统进行重大维护工作之后。
（5）对生物洁净环境产生影响的工艺变更之后。
（6）改变清洁或消毒方法之后。
（7）可能会造成生物污染的意外事故发生之后。
5、样品处理与培养
这也是生物污染受控环境有别于工业洁净室（ICR）检测的主要方面。截止目前，生物污染受控环境普遍采用的检测方法，其采样都要经过一定时间的培养才能得出结果。正因为如此，对生物洁净室的采样要格外细心，避免差错，通常要注意以下几个方面：
（1）样品标识
1）每个采样的样品都应包含以下信息，以便在获得培养数据后，为正确分析检测结果提供可靠的依据。
2）采集日期和时间。
3）采集当时进行的活动以及偏离采样计划之处。
4）采样人。
5）培养基类型。
（2）样品处理方法
样品从各采样点收集后，要运送到集中培养处，在运输或处理过程中不应影响所采集到的微生物的活性与数量，以下方面应予以注意：
1）运输和储存的条件是否适宜，进入正式培养前的时间是否偏长。
2）中和介质和渗透稀释液的正确使用。
（3）样品培养
培养基是按照所选定的微生物种类，并根据采样环境、采样方法及所使用的设备来确定的，不同微生物及培养基的培养条件有所不同。
为了保证采样与培养的结果有效，培养基的品质十分关键。除了其组分、性能的可靠外，培养基容器外表面的洁净度十分重要，通常需要二层或三层包装。如有可能，在选择培养基的培养温度和时间时，要考虑对预期采集到的微生物有利的生长条件。