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环境微生物的快速测定法

更新时间:2020-02-20  |  点击率:2353

一、菌落染色法
在含有氧化还原显,色试剂四唑嗡紫罗兰等的琼脂平板培养基上培养微生物,或者在普通的琼脂平板培养基上培养后,经过染色,很容易判别菌落是一种比标准培养时间更短的计测菌落的方法。
微观染色用于对培养结束的膜过滤器直接滴下染色液,然后让其干燥,将染成青色的菌落拿到10~20倍的放大镜下进行计测。培养时间可以缩短到原来方法的1/4~1/2。
二、阻抗法
微生物在增殖过程中会将蛋白质、碳水化合物等高分子化合物,分解成有机酸、氨基酸等离子化合物,这些离子化合物达到一定浓度,在周围环境中将产生微小的电量变化。将这个电量的变化利用电阻、导电性或者静电容量这些概念检测的方法,称为阻抗法。产生电量与开始时的细菌数、菌的增殖性成反比。因此,从预先求得的两者的标准曲线中可以推算出样品中初始的细菌数。作为产品化的系统有气压(或液压)传输系统以及细菌计数器。
实际操作如下:往容器中添加液体培养基和样品,放在组成系统的培养装置中开始培养。测定机逐时的自动监测培养过程中电量的变化。
本测定方法必须培养,但它和原来计测菌落的方法相比,优点在于培养时间可以缩短。培养开始后直到结果的打印输出*自动化,初始投资高但运行费用低。另外,通过组合选择性培养基,可应用于检测特定微生物。
三、氧化电极法
氧化电极法是一种将微生物增殖过程中的呼吸活性通过氧化电极检出的方法。与阻抗法一样,通过自动监测,逐时的测定随培养进度而产生的培养基中溶解氧的浓度,直到能够检出呼吸活性的培养时间,从这一时间推算样品中的开始菌数。测定时,向装有氧化极的容器中添加液体培养基和样品,然后放在组成系统的培养装置中开始培养,测定机自动监测培养基中溶解氧浓度的逐时变化。6h内就可以检出105CFU/g的开始菌数。
四、显色法
显色法是一种通过标识色素的色调变化来检测随微生物代谢产生的培养基pH值的变化和CO2生成的方法。通过自动监测检测出培养过程中标识色素的色调变化,从直到可以检测出色调变化的这一段培养时间推算出样品中的开始菌数。以培养基pH值变化为指标的维夫斯、以CO2生成为指标的敏化培养基/生物材料20都已产品化。
维夫斯使用容器,此容器中盛有包含标识色素的琼脂层与液体培养基。使用时,向容器中添加样品,放入组成系统的培养装置中开始培养。检出时间受开始菌数多少的影响,但如果达到106CFU,7个小时就可以检出。通过组合选择性培养基,也可应用于特定微生物的检出。

以上四种方法仍需培养,只是培养时间较传统方式缩短,有助于改善生物污染控制的工作效率,属于一类。以下几种方法则无需培养,属于另一类环境微生物快速测定法。
五、荧光染色法
利用荧光染色剂荧光染色细胞膜和细胞核等,使用荧光显微镜等将细菌检出的方法。染色机理不同的多种荧光染色剂,根据不同的组合也能识别出活菌和死菌。染色扫描RDI及D计数、真菌监视器扫描、生物絮凝等都已产品化。
染色扫描RDI在薄膜过滤器上过滤样品,荧光染色阻挡在薄膜过滤器上的微生物后,再进行激光扫描。荧光染色的30min,激光扫描3min即可结束。其结果可以作为图像表示在监测器画面上,也可以自动计测产生荧光的点数。D计数以及真菌监视器扫描是结合了荧光染色法与流体检查计数法的方法,可以连续测定液态样品。
六、LAL试验法
LAL试验法是利用鲎属的血球抽出物,检测来源于革兰氏阴性菌的内毒素的方法。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁成分的脂多糖,可以作为革兰氏阴性菌的指标。
七、SLP试验法
SLP试验法是利用蚕血液成分检出肽聚糖及β-葡聚糖的方法。肽聚糖是细菌的细胞壁成本,β-葡聚糖是真菌的细胞壁成分。因此,通过本试验法能够检出这些微生物。不过,每个微生物的肽聚糖及β-葡聚糖含量因菌株不同而差异很大,与LAL试验法一样,不能定量微生物,而且也不能识别出式来源于活菌还是死菌。
八、ATP快速测定法
ATP是高能磷酸化合物,分解时产生的能量用于细胞内各种有能量需求的反应。即ATP在地球上所有活着的细胞内发挥着类似于电池的功能,它的存在成为生命活动的证据。
(1)ATP法的测定原理
ATP法是利用萤火虫尾部发光反应的微生物测定法。来源于萤火虫的荧光素酶催化反应,以高量子收获率变换具有ATP的化学能源而发光。反应结果产生的光的数量即发光量和ATP量成正比,通过测定发光量就可以定量ATP。ATP不但存在于细菌体内,而且广泛存在游离于细菌体外的状态。细菌外ATP是指从活细菌中溶析出来,细菌死时被逐出,而且被包含在有机污染中。细菌外ATP影响活菌数的测定,因此在前处理阶段必须除去。另一方面,验证洁净度时,用细菌内外ATP量的总和(ATP总量)为污染指标的方法,在能够检出微生物及其温床污染两个方面的意义上是合理的。ATP法操作简单且能快速得到结果。
(2)以菌体内ATP量为指标测定活菌数
根据ATP法求活菌数时,在前处理阶段必须除去细菌体外的ATP。除去ATP的方法有酶化分解消去法和薄膜过滤器过滤除去法。酶化法原则上能适用于各种样品,但含有高浓度的蛋白质和脂肪的样品,有时不能充分除去细菌体外的ATP,测试前必须确认去除效果。而薄膜过滤器法不能用于引起堵塞的样品,但它不仅可以除去细菌外的ATP,而且还可以除去妨碍发光反应的物质,进而使微生物浓缩,有助于测试。
(3)空气中浮游菌数的测定
用空气取样器将空气中浮游菌捕集到琼脂培养基上进行培养之前,与原来方法相同。原来方法是培养2天后计测出现的菌落,与此相对,利用ATP法检测细菌成功的将培养时间缩短到6h。
根据NASA标准,在ISO 8级食品厂的洁净室,取样空气量为10ft3的条件下,探讨与原来方法的相关性。两测定值具有相关性,但其相关性很小,只能推算出大致的空气中浮游菌数。一般认为这是由于多种微生物浮游于空气中,各种微生物增殖速度和ATP含量不同的缘故。但是,虽不能准确求出细菌数,也可用于判定级别等某种程度上放宽范围的评价。